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多聚磷酸酶调控肌肉蛋白质凝胶特性的研究

信息来源:www.xyglchem.com | 发布时间:2021年06月15日

多聚磷酸盐是肉制品加工中常用的添加剂,它们可以改变肌肉的离子强度和pH,可以与蛋白的相互作用,解离肌动球蛋白复合物,多聚磷酸批发厂家增加蛋白质表面的净电荷数,改善肉或肉制品的保水性、嫩度和适口性。然而添加到肉中的多聚磷酸盐会在肉中多聚磷酸酶的作用下不断水解,其中焦磷酸盐和三聚磷酸盐主要通过焦磷酸酶(PPase)和三聚磷酸酶(TPPase)降解。本研究以猪背最长肌为实验材料,首先,分离纯化PPase和TPPase并其酶学特性进行研究。其次,利用免试剂离子色谱技术观测焦磷酸钠(TSPP)、三聚磷酸钠(STPP)及其复合物在纯化后PPase或/和TPPase的作用下多聚磷酸盐的量变和分子形态的动态变化。最后,研究TSPP, STPP和磷酸盐混合物在不同水解时段对肌肉匀浆物溶解性、流变特性和凝胶特性的影响。具体研究结果如下: 1焦磷酸酶的分离纯化与酶学特性研究 通过超速离心、硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析,从猪背最长肌中分离纯化出PPase。PPase在非变性电泳和变性电泳图谱上均呈现单一蛋白条带。PPase活性为0.43μmol·mg-1 protein·min-1,纯化倍数30.7,酶活回收率8%。PPase的底物专一性很强。但在反应体系内底物(TSPP)浓度超过3 mmolL-1时,将会抑PPase的活性。PPase最适反应温度和pH值分别为50℃和7.5。Mg2+是PPase必需金属离子,在4.75 mmol·L-1浓度时,对酶激活作用最强。Ca2+却酶的活性,NaCl和KCl均会酶的活性,NaCl的效应强于KCl。EDTA-Na2和EDTA-Na4在高浓度时对酶活有较强的作用。1mmol·L-1NaF可以完全酶的活性。PPase水解TSPP的动力学参数Km为0.36mmol·L-1PP, Vmax为0.086μmolPi·mg-1 protein·min-1。 2三聚磷酸酶的分离纯化与酶学特性研究 通过超速离心、分级沉淀和DEAE-52交换层析,从猪背最长肌中分离纯化出TPPase。证实三聚磷酸酶是肌球蛋白。TPPase纯化倍数4.12,回收率5.65%。TPPase的最适反应温度和pH值分别为40℃和6.0,Mg2+、Ca2+对TPPase均有激活作用,分别在0.5 mmolL-1和2.0 mmol·L-1浓度时使酶活达到最大。PP是TPPase的竞争性剂,PP添加浓度达到4 mol·-1时,相对酶活仅剩7.88%。盐离子NaCl和KCl对纯化后肌球蛋白TPPase均有作用,KCl的效应强于NaCl。EDTA-Na2和KIO3对酶活均有作用,Mg2+可以解除EDTA-Na2的效用。TPPase水解TPP的动力学参数Vmax为0.049μmol Pi·mg-1 protein·min-1, Km为0.37mmol·L-1TPP。 3多聚磷酸盐在纯化酶系统中水解的定量分析 利用免试剂离子色谱法测定多聚磷酸盐在纯化酶系统中水解变化。PP在PPase的作用下直接被水解成正磷酸盐(Pi),50min水解完毕。STPP水解分为两步,首先被水解PP和Pi,其次生成的PP被进一步水解成Pi。STPP在单一STPPase作用下水解非常缓慢,30 h仅有0.0376g·L-1STPP被水解,派生的TSPP的量一直在增加。而在PPase和STPPase共同作用下,水解过程中派生的TSPP会被迅速水解,没有任何积累,STPP在30h可以完全水解。

在TPPase作用下STPP和TSPP共存时,STPP水解更加缓慢,30 h仅有0.0111g·L-1 STPP被水解,TSPP在此水解期间不仅没有下降还上升了0.0065 g·L-1。TPPase和PPase共同作用于STPP、TSPP和HMP的混合物时(TSPP/STPP/HMP=1:1:1), STPP水解速率慢于TPPase和PPase共同作用STPP时。HMP水解比较缓慢,30 h还有大量未水解。研究证实肌球蛋白几乎没有焦磷酸酶活性,多聚磷酸盐以混合形式添加时其各组分总体水解速率会变慢,主要原因是TSPP会STPP水解。 4多聚磷酸盐水解对猪肉匀浆物流变特性和凝胶特性的影响 TSPP、STPP、磷酸盐混合物A (TSPP/STPP/HMP=2:5:2)和磷酸盐混合物B(TSPP/STPP/HMP= 5:2:2)的添加可以提高肌肉匀浆物蛋白质溶解度,降低蛋白浊度。多聚磷酸盐的添加可以有效提高肌肉蛋白凝胶过程中最终贮能模量G'值。多聚磷酸酶剂EDTA-Na2的添加能延缓TSPP和STPP的水解,从而提高肌肉蛋白质凝胶强度和凝胶保水性。单独添加0.1%的TSPP或STPP时,肌肉凝胶的保水性在24 h时会出现下降趋势,而等量混合磷酸盐添加后在24 h时的凝胶保水性不会下降。说明磷酸盐以混合的形式添加凝胶的保水性比较好,且稳定性比较好,其中磷酸盐混合物B保水性好。多聚磷酸盐对凝胶强度影响的主次顺序是:磷酸盐混合物A STPPTSPP磷酸盐混合物B。多聚磷酸盐的添加对凝胶弹性影响不大。